{"id":25868,"date":"2015-03-23T14:47:23","date_gmt":"2015-03-23T13:47:23","guid":{"rendered":"https:\/\/renewable-carbon.eu\/news\/?p=25868"},"modified":"2015-05-06T15:00:25","modified_gmt":"2015-05-06T13:00:25","slug":"kostenguenstige-bio-kaskade-fuer-caprolactam-synthese","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/renewable-carbon.eu\/news\/kostenguenstige-bio-kaskade-fuer-caprolactam-synthese\/","title":{"rendered":"Kosteng\u00fcnstige Bio-Kaskade f\u00fcr Caprolactam-Synthese"},"content":{"rendered":"

\u03b5-Caprolactam kommt als Monomer f\u00fcr die Herstellung von Nylon-6 bzw. Polyamid-6 zum Einsatz und findet breiteste Anwendung u.a. in der Textilindustrie oder bei der Herstellung technischer Formteile. Chemiker der Uni Graz haben nun ein neues, kosteng\u00fcnstigeres und umweltfreundlicheres Verfahren zur Herstellung des wichtigen Grundbausteins entwickelt.<\/strong><\/p>\n

Die Produktion des Nylon-6 Monomers \u03b5-Caprolactam stellt mit 4,2 Millionen Tonnen pro Jahr einen der gr\u00f6\u00dften und bedeutendsten industriellen Prozesse dar [1 – 3]. Die Herstellung dieser Grundsubstanz zahlreicher Nylon-basierter Produkte erfolgt \u00fcber die Umsetzung von Cyclohexanon mit Hydroxylamin zum entsprechenden Oxim und anschlie\u00dfender Beckmann-Umlagerung (s. Abb. 1). F\u00fcr die Bereitstellung von Hydroxylamin wird Ammoniak und Wasserstoffperoxid ben\u00f6tigt. Die Umlagerungsreaktion l\u00e4uft in Gegenwart starker S\u00e4uren ab, was zu einer signifikanten Menge an Salzen durch die nachfolgende notwendige Neutralisation des Reaktionsgemisches f\u00fchrt.<\/p>\n

In einer k\u00fcrzlich publizierten Studie [4] wurde ein Konzept f\u00fcr eine k\u00fcnstliche enzymkatalysierte Kaskade entworfen, die, ausgehend von Cyclohexanol, die Darstellung der hydrolysierten \u03b5-Caprolactam-Verbindung 6-Aminohexans\u00e4ure erlaubt. Letztere kann durch W\u00e4rmebehandlung in \u03b5-Caprolactam umgewandelt werden.<\/p>\n

Diese Kaskade wurde in zwei Module, die in sich redox-neutral sind, unterteilt: Modul 1 kombiniert die Oxidation des Cyclohexanols mit einer Baeyer-Villiger Monooxygenase, welche unter Verbrauch von Sauerstoff \u03b5-Caprolacton produziert (s. Abb. 2) [5]. Die NADPH-Cofactor-Abh\u00e4ngigkeit dieses Moduls wird durch die strikte Affinit\u00e4t der Bayer-Villiger Monooxygenase (BVMO) bez\u00fcglich des Cofaktors NADPH bestimmt. Das in der Oxidationsreaktion des Cyclohexanols zu Cyclohexanon gewonnene Hydrid in Form von NADPH wird in diesem Modul in der enzymatischen Baeyer-Villiger Reaktion wieder verbraucht, wodurch das notwendige NADP+ f\u00fcr die erste Stufe wieder generiert wird.<\/p>\n

\u03b5-Caprolacton wird in Modul 2.0 durch eine Hydrolase (Lactonase) ge\u00f6ffnet, sodass eine \u03c9-Hydroxys\u00e4ure gebildet wird. Oxidation der prim\u00e4ren Alkoholfunktion mittels einer Alkoholdehydrogenase (prim-ADH) und reduktive Aminierung des entstehenden Aldehydes mit einer Transaminase (\u03c9-TA) f\u00fchren unter Umwandlung des Aminodonors L-Alanine zu Pyruvat und zur Bildung des gew\u00fcnschten Produktes 6-Aminohexans\u00e4ure. Das Nebenprodukt Pyruvat wird unter Verbrauch von Ammoniak durch eine Alanin-Dehydrogenase (AlaDH) zu L-Alanine rezykliert, wobei auch hier wiederum das in der Oxidationsreaktion des prim\u00e4ren Alkohols zum Aldehyd gewonnene Hydrid (NADH) direkt in der reduktiven Aminierung des Pyruvats zum Alanin verwendet wird, was eine Rezyklierung des Aminodonors innerhalb der enzymatischen Kaskadenreaktion darstellt. Dieses Rezyklisierungsystem arbeitet unter Einsatz von NAD+-abh\u00e4ngigen Enzymen, um so die Kompatibilit\u00e4t des Cofaktor-Systems zu Modul 1 zu gew\u00e4hrleisten, welcher NADP(H) abh\u00e4ngig ist.<\/p>\n

Diese Kaskade sollte die Synthese der 6-Aminohexans\u00e4ure alleine unter Verbrauch von Sauerstoff und Ammoniak als st\u00f6chiometrische Reagenzien erm\u00f6glichen.<\/p>\n

W\u00e4hrend Modul 1 f\u00fcr sich alleine mit 96 % Umsatz von Cyclohexanol zu \u03b5-Caprolacton extrem effizient arbeitete, erwies sich die durch die Hydrolase gebildete \u03c9-Hydroxys\u00e4ure innerhalb des Moduls 2.0 im Laufe der Untersuchungen als inhibierendes Intermediat.<\/p>\n

Weiterentwicklung des Moduls 2.0 zur Caprolactam-Produktion<\/h3>\n

Modul 2.0 konnte die durch die Hydrolase gebildete 6-Hydroxyhexans\u00e4ure nur ungen\u00fcgend weiter umsetzen. Tests f\u00fcr \u00e4hnliche Umsetzungen mit analogen Substraten wie 1-Hexanol oder auch 6-Hydroxyhexans\u00e4ureethylester bzw. des entsprechenden Methylesters anstatt der 6-Hydroxyhexans\u00e4ure f\u00fchrten sehr wohl zu den entsprechenden prim\u00e4ren Aminen mit vollst\u00e4ndigem Umsatz.<\/p>\n

Somit musste eine Strategie entwickelt werden, welche die Inhibierung durch die S\u00e4urefunktion von 6-Hydroxyhexans\u00e4ure verhindert.<\/p>\n

Der Einsatz alternativer prim\u00e4rer Alkoholdehydrogenasen, die in der Literatur als \u201eSpezialisten\u201c bez\u00fcglich dem Substrat 6-Hydroxyhexans\u00e4ure bekannt sind (zwei ADHs aus Acinetobacter sp. bzw. Brevibacterium epidermitis), scheiterte an deren geringen Stabilit\u00e4t und der schwierigen heterologen Expression in E.coli als Wirtsorganismus.<\/p>\n

Als L\u00f6sung dieses Problems wurde im Rahmen der hier beschriebenen Arbeit die Ring\u00f6ffnung des Lactons mit Methanol oder Ethanol als Nukleophil anstelle von Wasser in der w\u00e4ssrigen Pufferl\u00f6sung erwogen. Dies f\u00fchrt zur Bildung des Esters anstatt der S\u00e4ure, daher w\u00fcrde die S\u00e4urefunktion maskiert und die Inhibierung k\u00f6nnte umgangen werden. Ein Enzym, das eine solche Reaktion im w\u00e4ssrigen Medium erlaubt, war jedoch in der Literatur nicht bekannt. Methanol bekam gegen\u00fcber Ethanol den Vorzug, weil Ethanol f\u00fcr die prim\u00e4re Alkoholdehydrogenase selbst ein gutes Substrat darstellen w\u00fcrde und dies zu unerw\u00fcnschten Nebenprodukten beziehungsweise Problemen im internen Cofactor-Rezyklierungssystem des Moduls 2.0 f\u00fchren k\u00f6nnte.<\/p>\n

Ein Screening innerhalb der Hydrolasen-Familie nach Lactonasen und Lipasen mit der gew\u00fcnschten Selektivit\u00e4t blieb jedoch erfolglos. Innerhalb der Familie der Esterasen (18 getestete Esterasen) konnten jedoch vier Enzyme identifiziert werden, die die gew\u00fcnschte Reaktion (teilweise) durchf\u00fchrten. Im Detail waren dies eine Esterase aus Bacillus subtilis (deren Kristallstruktur bereits bekannt ist, siehe pdb 2R11), zwei Esterasen aus der Schweineleber (die Isoenzyme PLE03 und PLE06) sowie eine kommerzielle Roh-Pferdeleberpr\u00e4paration. Da die Schweineleberesterasen mit den Pferdeleberesterasen strukturell verwandt sind, kann davon ausgegangen werden, dass tats\u00e4chlich die Esterasen die Reaktion katalysieren und nicht ein anderes Enzym innerhalb der Pferdeleber-Pr\u00e4paration.<\/p>\n

Bis zu 75% Umsatz mit Pferdeleberesterase<\/h3>\n

Das so zu Modul 2.1 (s. Abb. 3) umfunktionierte urspr\u00fcngliche Modul 2.0 (vergleiche Abb. 2) liefert in Anwesenheit von 10% Methanol (v\/v) das gew\u00fcnschte Produkt 6-Aminohexans\u00e4ure mit 47% Umsatz, wenn die Esterase aus Bacillus subtilis f\u00fcr die Ring\u00f6ffnung zum Einsatz kam. Im Falle der Schweineleberesterase PLE03 wurden 29% Umsatz erhalten. Das beste Resultat konnte mit der Pferdeleberesterase-Pr\u00e4paration erhalten werden. Hier wurden 75% des Lactons innerhalb des verbesserten Moduls 2.1 zu 6-Aminohexans\u00e4ure umgesetzt.<\/p>\n

Eine Kombination aus Modul 1 und Modul 2.1 blieb zun\u00e4chst ineffektiv, weil die Baeyer-Villiger Monooxygenase nur eine geringe Stabilit\u00e4t in Gegenwart von Methanol als Co-L\u00f6sungsmittel besitzt. Eine Reduktion von 10% auf 2% Methanol f\u00fchrte zu einem Umsatz von 30% zur 6-Aminohexans\u00e4ure.<\/p>\n

Durch Zugabe von Methanol zum Reaktionspuffer und dem Einsatz von Pferdeleberesterase konnte die S\u00e4urefunktion im Rahmen der Ring\u00f6ffnung des Lactons maskiert werden, wodurch diese Inhibierung und eine daraus resultierende Akkumulierung dieses Intermediates verringert wurde.<\/p>\n

 <\/p>\n

Literatur<\/h3>\n

[1] HH. A. Wittcoff, B. G. Reuben, J. S. Plotkin, in Ind. Org. Chem., John Wiley & Sons, Inc., 2012, pp. 349\u2013354.<\/p>\n

[2] J. Ritz, H. Fuchs, H. Kieczka, W. C. Moran, in Ullmann\u2019s Encycl. Ind. Chem., Wiley-VCH, Weinheim, 2011, DOI: 10.1002\/14356007.a05_031.pub2.<\/p>\n

[3] JG. Bellussi, C. Perego, CATTECH 2000, 4, 4\u201316.<\/p>\n

[4] J. H. Sattler, M. Fuchs, F. G. Mutti, B. Grischek, P. Engel, J. Pfeffer, J. M. Woodley, W. Kroutil, Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 14153-14157. DOI: 10.1002\/anie.201409227. http:\/\/onlinelibrary.wiley.com\/doi\/10.1002\/anie.201409227\/abstract<\/p>\n

5] H. Mallin, H. Wulf, U. T. Bornscheuer, Enzyme Microb. Technol. 2013, 53, 283\u2013287.<\/p>\n

[6] S. Staudt, U. T. Bornscheuer, U. Menyes, W. Hummel, H. Gr\u00f6ger, Enzyme Microb. Technol. 2013, 53, 288\u2013292.
\n* Dr. J. H. Sattler, Prof. Dr. W. Kroutil : Universit\u00e4t Graz, Institut f\u00fcr Chemie, Organische\/Bioorgansiche Chemie, 8010 Graz<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

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