{"id":20579,"date":"2014-05-26T03:03:48","date_gmt":"2014-05-26T01:03:48","guid":{"rendered":"https:\/\/renewable-carbon.eu\/news\/?p=20579"},"modified":"2014-05-23T18:12:11","modified_gmt":"2014-05-23T16:12:11","slug":"bakterielle-biokunststoffproduktion-durchflusszytometrisch-verfolgt","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/renewable-carbon.eu\/news\/bakterielle-biokunststoffproduktion-durchflusszytometrisch-verfolgt\/","title":{"rendered":"Bakterielle Biokunststoffproduktion durchflusszytometrisch verfolgt"},"content":{"rendered":"

In den letzten Jahren sind die Durchflusszytometrieger\u00e4te g\u00fcnstiger in der Anschaffung aber auch gleichzeitig leistungsst\u00e4rker in der Analyse von Bakterien geworden. Im Europ\u00e4ischen Forschungsprojekt SYNPOL untersuchen Wissenschaftler so die bakterielle Biokunststoffproduktion aus Synthesegas w\u00e4hrend des Bioprozesses im Bioreaktor.<\/p>\n

Der Bedarf an umweltfreundlichen Kunststoffmaterialien ist in den letzten zehn Jahren enorm gestiegen, die weltweite Produktion von rund 1,4 Mio t (f\u00fcr das Jahr 2012, http:\/\/en.european-bioplastics.org<\/a>\/) kann diesen Markt jedoch nicht in gen\u00fcgender Menge und kosteng\u00fcnstig beliefern. Zurzeit sind zwei Hauptklassen von Biokunststoffen auf dem Markt erh\u00e4ltlich: biobasierte\/nicht abbaubare und biologisch abbaubare Kunststoffe. Vorteil der biobasierten Kunststoffe wie Bio-Propylen ist, dass sie aus nachhaltigen Ressourcen produziert werden und die industrielle Verarbeitung wegen des erd\u00f6lbasierten und ansonsten identischen Polymers Polypropylen bereits gut etabliert ist.<\/p>\n

Der zu Polypropylen entsprechende und biologisch abbaubare Kunststoff ist Poly ([R]-3-hydroxybutyrat) (PHB) und wird wegen der enantiomeren Reinheit und des hohen Molekulargewichtes (Mw > 600 kDa) ausschlie\u00dflich biotechnologisch im bakteriellen Bioprozess hergestellt. Dabei lagern die Zellen das PHB als Kohlen- und Energiespeicherstoff im Zellinnern ein, welches mit hydrophoben F\u00e4rbemitteln, wie Sudan schwarz oder dem Fluorszenzfarbstoff Nilrot (s. Abb. 1), im Mikroskop visualisiert werden kann. Der Gehalt von PHB kann im Bakterium bis zu 90 % der Trockenmasse betragen, wenn Glukose als C-Quelle und eine Wachstumslimitation durch das N\u00e4hrstoffelement Stickstoff oder Phosphor vorliegt. Mittels L\u00f6semittelextraktion kann PHB aufgereinigt und als Verpackungsmaterial oder sogar medizinisch biokompatibler Werkstoff verwendet werden [1].<\/p>\n

Nachhaltige PHB-Produktion<\/h3>\n

Um die Biokunststoff-Herstellung von der Lebensmittelproduktion zu entkoppeln und damit einen Konflikt um Rohstoffe zu vermeiden, wurde in den letzten Jahren vermehrt nach alternativen Kohlenstoffquellen gesucht. Die Verwertung von Abfallstoffen aus der Lebensmittelindustrie (z.B. Abf\u00e4lle aus der Fleisch- und Milchindustrie) stellen dabei eine sehr interessante Alternative dar [2]. Mit geeigneter enzymatischer und\/oder chemischer Vorbehandlung werden diese Abf\u00e4lle zu gut verwertbaren Kohlenstoffquellen, darunter Fetts\u00e4uren und Zucker. Der zus\u00e4tzliche Aufbereitungsschritt bewirkt jedoch gleichzeitig h\u00f6here Herstellungskosten.<\/p>\n

Syngas als Kohlenstoffquelle<\/h3>\n

Ein interessanter Ansatz wird im europ\u00e4ischen Forschungsprojekt SYNPOL (FP7, s. Abb. 2) verfolgt. Im Rahmen der europ\u00e4ischen Energiediskussion ist die Verwertung von organischen Abf\u00e4llen zu Synthesegas ein wichtiges Forschungsprojekt der Industrie geworden. Synthesegas oder auch Syngas genannt, wird bei der thermischen Umwandlung von organischen Materialien bei ca. 600-900 \u00b0C in CO, H2<\/sub>, CO2<\/sub>, N2<\/sub> und Spuren anderer Gase umgewandelt [3]. Syngas wurde bereits in den 1930er Jahren zur energetischen Verwertung benutzt und gilt heute als ein gr\u00fcner Energiespeicher und auch wertvoller Ausgangsstoff f\u00fcr die chemische Synthese. Wegen des relativ hohen CO-Anteils von 30-40% f\u00fchrt die thermische Verwertung wiederum zur unerw\u00fcnschten Bildung von CO2<\/sub>. Hier setzt das EU-Forschungsprojekt Synpol (www.synpol.org) unter der Leitung von Prof. J. L. Garc\u00eca am Consejo Superior de Investigaciones Cient\u00edficas (CSIC) in Madrid an: Das gebildete CO soll mittels Fermentation von Clostridien (Universit\u00e4t Ulm, Deutschland) in wertvolle Polymerbausteine umgewandelt werden bzw. PHB soll mittels Rhodospirillum rubrum (CSIC und HES-SO Valais \u2013 Wallis, Schweiz) direkt oder nach genetischer Rekombination in Ralstonia eutropha (Westf\u00e4lische Wilhelms-Universit\u00e4t M\u00fcnster, Deutschland) indirekt hergestellt werden. An der Hochschule f\u00fcr Ingenieurwissenschaften mit Standort Sitten, Schweiz (HES-SO Valais \u2013 Wallis) wurde in Zusammenarbeit mit dem Synpol-Industriepartner Infors HT (Bottmingen, Schweiz) eine sichere und moderne Fermentationsplattform zur anaeroben Verwertung von Syngas aufgebaut (s. Abb. 3). Diese Plattform wird zurzeit mit Process Analytical Technology (PAT) erg\u00e4nzt, unter anderem auch die automatisierte Analyse des PHB-Gehaltes mittels Durchflusszytometrie.<\/p>\n

Die Durchflusszytometrie im Synpol Projekt<\/h3>\n

Seit den 1970er Jahren hat die Durchflusszytometrie gro\u00dfe Entwicklungsschritte bez\u00fcglich ihrer Lasertechnologie und Durchflusszelle erzielt. Die Ger\u00e4te sind kleiner, kosteng\u00fcnstiger und anwendungsfreundlicher geworden. So konnten die sehr gut etablierten Anwendungen im Medizinbereich (z.B. Immunologie, H\u00e4matologie) mit der Entwicklung neuer Fluoreszenzfarbstoffe und Lichtfilter auf die Analyse von Mikroorganismen adaptiert werden. Im Lebensmittelsektor und neuerdings auch in der Trinkwasseraufarbeitung, hat die Durchflusszytometrie unterdessen ihren festen Platz gefunden [4]. Die industrielle Anwendung der Durchflusszytometrie in der Produktion von PHB ist jedoch noch nicht etabliert.<\/p>\n

Erste Ans\u00e4tze wurden in den fr\u00fchen 1980er Jahren mit Nilrot als lipophiler Fluoreszenzfarbstoff durchgef\u00fchrt [5]. Starke Hintergrundf\u00e4rbung, schnelles Ausbleichen und die relativ lange F\u00e4rbezeit erschwerten die Handhabung im Forschungslabor. Erst mit der Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffes BODIPY 493\/503 konnte die F\u00e4rbung verbessert und die Fluoreszenzsignale eindeutig f\u00fcr die Quantifizierung des PHB-Gehaltes in der Zelle benutzt werden [6]. Diese PHB-Analysemethode bietet f\u00fcr die Syngas-Fermentation mit R. rubrum entscheidende Vorteile: Die Messresultate sind noch w\u00e4hrend der Fermentation, sogar beinahe in Echtzeit, verf\u00fcgbar und es werden nur kleine Probenvolumina (0,5 mL mit optimal 106 Zellen mL-1) ben\u00f6tigt. Diese Vorteile sind umso wichtiger, da eine erste Fermentation gezeigt hatte, dass eine Batchkultur mehr als eine Woche in Anspruch nehmen kann.<\/p>\n

Die gut etablierte Analyse des PHB-Gehaltes von gefriergetrockneten Bakterien mittels Gaschromatografie ist sehr arbeitsaufw\u00e4ndig, ben\u00f6tigt mindestens 50 mg Biomasse und dauert in der Regel bis zu f\u00fcnf Tage bis zur vollst\u00e4ndigen Auswertung. Da die Zellkonzentration zu Beginn von Batchkulturen sehr niedrig ist, wird ein gr\u00f6\u00dferes Probenvolumen ben\u00f6tigt. Daher wird im Synpolprojekt eine volle Automatisierung der PHB-Quantifizierung mittels Durchflusszytometrie angestrebt, auch um die Probenmenge m\u00f6glichst klein zu halten und den Bioprozess auch w\u00e4hrend der Randzeiten verfolgen zu k\u00f6nnen.<\/p>\n

Automatisiert und online<\/h3>\n

F\u00fcr die Online-Durchflusszytometrie gibt es bereits Ger\u00e4te auf dem Markt, die f\u00fcr die Qualit\u00e4tskontrolle von Trinkwasser vorgesehen sind. Stichproben des Wassers werden automatisch entnommen, mit Fluoreszenzfarbstoff gef\u00e4rbt und die Zellzahl bestimmt [4]. Da diese Ger\u00e4te jedoch nur Zellzahlen zwischen 102 und 106 Zellen mL-1 korrekt messen k\u00f6nnen, muss f\u00fcr die Verfolgung der PHB-Produktion \u2013 speziell f\u00fcr Bioprozesse mit hohen und stets zunehmenden Zelldichten \u2013 ebenfalls eine flexible, automatische Verd\u00fcnnung bis zu einem Faktor 1000 etabliert werden. Verschiedene Ans\u00e4tze basieren auf dem grafischen Programmiersystem Labview (National Instruments), das die einfache Modifikation der Verd\u00fcnnungs- und F\u00e4rbeschritte erlaubt. Messintervalle von 15 Minuten sind gut realisierbar [7,8]. Zurzeit wird an der HES-SO ein neues Analysesystem entwickelt, das die Messzeit weiter reduzieren soll. Im Rahmen des Synpol-Projektes wird das Online-Durchflusszytometer f\u00fcr die Wahl des optimalen Fermentationsprozesses (Fed-Batch oder Chemostat) und der entsprechenden Mediumsoptimierung eingesetzt werden.<\/p>\n